成年果蝇活动的高清晰视频跟踪分析
Justin B. Slawson, Eugene Z. Kim,andLeslie C. Griffith
National Center for BehavioralGenomics,Department of Biology, Volen CenterforComplex
Systems,BrandeisUniversity
摘要：
果蝇为研究者提供了一种重要的学习由基因工具引起复杂行为的模型。学习果蝇的活动行为依赖于确定它们在运动时候或者对某种刺激回应的时候大量的变化的能力。因此, 高清晰视频跟踪系统，如我们在本文所描述的，是一种有价值的测量实时运动的工具。我们的计划研究用到在一方室中开始空气冲击打断果蝇运动势头之后三十秒的摄像。然后使用一个视频跟踪程序计算在方室中每10毫秒各果蝇的瞬时速度速。然后分析软件分析数据，并输出各种参数，如平均速度，最大速度，运动时间，加速度等。此实验计划讨论针对行为实验的适当饲养管理方法，不用麻醉或者固定等手段处理果蝇，建立一个从实验开始到结束的受控制的环境。成年果蝇活动的高清晰视频跟踪分析
实验计划
第一部分：果蝇的饲养和管理
1.果蝇应该生长在含有无酵母的标准媒质的瓶子中。你需要大量的果蝇，所以相应的杂交系需要设立。果蝇应该成长于具有12小时明亮/黑暗周期的25℃环境。
2.实验用果蝇应当在羽化后不久(1-3天)内收集起来，这个阶段的果蝇可以接受二氧化碳扩散的刺激后收集，它们应当被存放在经过高压蒸汽灭菌或者无酵母媒体的试管中。我们只采用雄性果蝇，每10只一个试管成年果蝇活动的高清晰视频跟踪分析
3.在进行这个行为学实验前，最好不要距离使用二氧化碳操作两天以内，至少要隔一天。我们进行果蝇的行为学分析是在其羽化后3-5天。
4.为了避免昼夜节律问题，检测应当在每天相同的2-3个小时内进行。
第二部分：建立在手控环境中的跟踪系统
1.所有的实验在一个恒温25摄氏度湿度70%的环境空间中
2.悬挂一个数码摄像设备在实验区域上方来记录实验情况（镜头向下拍摄）。由于我们的轨道分析软件有对比要求，我们将镜头穿过一个明亮的盒子进行摄像。镜头记录的录像将经由直接输入到Dell电脑。我们使用夏普数字摄像头，连接到Dell计算机的Windows Moviemaker（Vista 版本）用于视频获取。成年果蝇活动的高清晰视频跟踪分析
3.空气冲击将在此计划书中规定使用，因此一个空气冲击源在实验室中放置，连接着空气活性碳过滤器。
4.再次使用橡胶管，接在活性碳空气过滤器的另外一端，连接到锥形烧瓶并加上一个胶管夹，将烧瓶填至一半水，用来湿润空气。成年果蝇活动的高清晰视频跟踪分析
5.烧瓶同样拥有一个侧臂，用橡胶管连接到Y形阀门。
第三部分：转移果蝇至实验空间
1.方形的运动实验空间是基于Wolf et al.20011的方案设计的，添 加了小的下降轨道，用来防止果蝇在运动空间中飞行。此空间在使用前拆卸成几个小部件，各组成部分都会经过70%的乙醇消毒，并且烘干。
2.开始行为监控前的瞬时麻醉会很可能影响果蝇的应激行为。为了避免这种情况，果蝇通过敲击试管经过一个小出口的漏斗进入实验空间。为了制造一个合适大小的出口，附加一个蓝色移液管尖（P1000规格）到漏斗的尖端。然后使用剪刀，减去移液管尖的适当长度直到确保足够一只果蝇通过。成年果蝇活动的高清晰视频跟踪分析
3.我们的活动空间室顶部是一个由螺丝固定的有机玻璃小板，当螺丝被拆除的时候，此螺丝孔可被用于果蝇通过进入活动室。将有机玻璃孔定位在顶部位置的螺丝孔，以便让螺丝直接通向活动室内，而不是通常螺丝固定在侧壁。取一个含有果蝇的测试试管倒放在即将置于螺丝孔的漏斗上
4.不要移动漏斗，因为这可能会伤害或杀死果蝇。相反，轻轻地敲打漏斗试管和活动室，直到所有的果蝇进入活动监测室。敲击的动作应当在一个鼠标垫上完成来吸收敲击的冲击。当果蝇全部进入实验空间时撤去漏斗，重新将有机玻璃盖放在螺床上，然后重新旋紧螺丝。成年果蝇活动的高清晰视频跟踪分析
第四部分：启动自动监测
1.一旦果蝇正确得进入后，让他们在新环境中适应30分钟。这段适应期应该在受控环境（25℃，70%湿度），并且活动箱应该放置在灯箱上（灯开着）。
2.紧接着适应期，打开空气压缩Y形活塞，使空气只能流向计流器哪一方。打开空气开关，调节空气流速到理想速度（4.0-6.0L/min）。我们通常使用的标准是5.0-6.0L/min，但是那个范围内的任何流速都是适用的。成年果蝇活动的高清晰视频跟踪分析
3.一旦达到所需的空气速度，切换Y型阀使空气流向运动箱。计时15秒后，迅速关闭空气。当空气停止进入的时候，瞬间将摄像头调整为摄影模式。
4.在记录了预期时间后停止录影并保存。我们使用了30秒不低于10帧的录像（每个基因型至少实验8次）。成年果蝇活动的高清晰视频跟踪分析
第五部分：记录视频的分析
1.我们用动态图像分析系统（DIAS）3.2版来获得运动轨迹，为了使用这个软件，我们首先我们的视频用QuickTime7.5.5转换到AVI文件格式
2.要基于对比度跟踪根果蝇，我们使用“Autotrace byThreshold”功能。We然后使用“Make Path from Trace”功能来数字化这些行踪。成年果蝇活动的高清晰视频跟踪分析
3.为输出每个果蝇的瞬时速度，我们使用“Compute Parameters”函数产生一个数据库文件（DIAS-specific）。使用这个函数的时候，我们用“5,15,60,15,5”参数的Tukey Smoothing使数据更加流畅。
4.一旦这些数据以一个数据库文件输出，它可以在Microsoft Excel中打开。我们使用Matlab的脚本在Excel内计算瞬时速度，同时其他参数的计算需要理解运动力学和运动学一轮结构。成年果蝇活动的高清晰视频跟踪分析
代表性成果
图1显示了Canton S野生型个体的代表性运动轨迹（图1左侧图）和无dCASK基因果蝇的运动轨迹，这是由两个大近交系交配产生的删除(Df(3R)×307andDf(3R)×313)（图1，右图）。无dCASK果蝇的运动经过Buridan’sParadigm3证实有问题，我们样方，与Canton S相比，表现出远远更少的运动量。我们始终先进行野生型实验以确保特定的某天内的条件和行为都在正常范围内。我们在的测试天中观测到与标准的果蝇反应偏差小于5％。所以认为这些差异通常是由我们环境参数控制引起的。
讨论
在我们的设定中，一个中等强度的空气冲击瞬时中断果蝇运动。当空气冲击结束时，果蝇将离开这静止状态并正常的运动，如图2所示。因为空气冲击有效地同步所有果蝇个体运动，我们用它来开始实验记录，同时我们也研究了运动中断刺激之后的运动开始情况。不过，该实验方法也可以在没有空气冲击的情况下做，因为自发活动参数不受空气冲击启用与否的影响（图2）。
一个经常出现的自动分析运动问题出现了。跟踪程序难处理是果蝇交 叉或者相碰之后的运动。这些情况往往导致在交错过程中暂时失去“一个对象的视线”，然后作为一个新的个体在碰撞后重新发现。其结果是输出一个比实际上存在试验箱中更多的对象追踪结果。很多人用追踪单一果蝇的方法来解决这个问题。但是很显然这里有个问题，单一果蝇个体的行为可能与果蝇种群的行为是十分不同的，这是由果蝇不同的社会角色决定的（在Drosophil的行为与运动4中提到），当然这不一定是坏事，取决于你在研究什么，但对于我们的目的来说，我们更喜欢使用数量的增加我们的果蝇数据统计力量。正因为如此，我们在处理两种方式的冲突。首先我们仅仅使用8-10只果蝇用于每次实验（在56mm立方体箱子中），使得他们之间的碰头减少到最小，然后，在我们的30秒试验中，我们仅仅分析至少18秒的时间。由此，我们总是有足够的时间来捕捉记录整个群体全部运动。这也保证了我们的样本量总是反映一次实验的果蝇数目，随着运动小片段被丢弃，该视频的总长度只有30秒。成年果蝇活动的高清晰视频跟踪分析
数据分析是这整个实验中最困难的部分。最重要的跟踪数据分析步骤是确定噪声和运动之间的区别。DIAS（如许多其他程序）将几乎得不到0 mm / s的速度，即使在果蝇已停止移动。正因为如此，看数据输出的同时一帧一帧地观看录像来确定什么时候果蝇确实在运动什么时候他们实际上没有运动是很重要的。在我们的设定中，所有低于1mm/s的速度都看作是噪音，这符合其他团体使用DIAS对成年果蝇的观测结果1。至于动力学上的一轮结构，还需要定义什么是一轮。我们定义活动为3个或更多的连续帧以上的速度高于1mm/s，定义3个或更多的连续帧低于这个阈值为静止
数据还必须妥善平滑以消除偶尔发生光源闪烁和摄像失真。目前没有标准的数据平滑方法，但重要的是，平滑过程不会改变数据总体趋势数据太大，而且不会产生模糊。我们两次使用“5,15,60,15,5”参数Tukey window去平滑数据，因为它似乎消除任何显然错误的大跳跃或速度的变化，但不会改变总体趋势和数据的本质。成年果蝇活动的高清晰视频跟踪分析
认识到不同的设置和环境会产生不同的行为结果是重要的。我们的建议任何一个建立一个跟踪分析的人，带着所有这些问题去实验，直到找到产生的数据与配视觉看到的相匹配一个方法，然后尽可能用同一种方法处理所有数据方式。
选择正确的跟踪程序也很重要。虽然我们使用数字报站器3.2（www.solltechnologies.com ），这绝不是最好的或唯一的系统可用。跟踪单个果蝇，丹瓦伦特（Mitra Lab,CSHL）已经开发了一个名为Ftrack的程序。对于多个果蝇集体运动（即可能发生碰撞交错的），克里斯汀布兰森（Dickinson/PeronaLabs,加州理工学院）已经开发了一个名为Ctrax的程序。Ftrack可在www.chronux.org下载，而Ctrax可在www.dickinson.caltech.edu/Research/Mtrax得到。Ethovision软件（Noldus，荷兰）是另一种强大的视频软件，同时可用单个和多个果蝇的跟踪，但是它只能商业购买，而且相当昂贵。
如果您已设置了跟踪检测，并不能得到理想的录像，有几个方面可以考虑一下。昼夜节律的问题往往是其中之一。当进行行为的实验的时候，一要始终确保不在果蝇的午休期间进行实验。由于我们目前感兴趣的基因使果蝇自发行为减少，我们宁愿让果蝇在近傍晚活动高峰（当地时间的下午8-10点）进行实验。另一个问题，空气源的不稳定空气流速也可以从上影响实验结果。实验开始之前，一定要使用空气流量计测试，确定它不会在15秒内空气流量波动很大。最后，遗传背景可以在所有的行为实验中产生作用，所以本实验的一些参数可能需要针对本实验的遗传背景来进行特定的优化。成年果蝇活动的高清晰视频跟踪分析
感谢
这项工作是由美国医疗卫生补助R01 GM54408号颁发给L.C.Griffith的。我们感谢Fred Wolf为我们设计的方形实验空间支持并构架录像系统，感谢Brandeis University机械工程工作室的Frank Mello制作了实验空间，感谢Dan Valente 和Tim Lebestky的分析方法上的具有极大帮助意义的讨论。
参考文献
1. Wolf FW, RodanAR,Tsai LT, et al. J Neurosci 2002;22(24):11035.[PubMed:12486199]
2. SollDR.International review of cytology 1995;163:43.[PubMed:8522423]
3. Martin JR, OlloR.The EMBO journal 1996;15(8):1865. [PubMed: 8617233]
4. Levine JD, FunesP,Dowse HB, et al. Science (New York,N.Y2002;298(5600):2010.
图1
DIAS生成的果蝇运动轨迹
上图为野生型果蝇（上，左）和运动缺陷型果蝇dCASK（上，右）的代表性的轨迹
这些轨迹展示了录制的视频中的果蝇运动情况，同样由含有8-10果蝇的运动箱中经过空气冲击后30秒内的运动轨迹
图2
野生型果蝇的自发活动实验结果，紫色为空气冲击后活动情况，蓝色为无空气冲击。横坐标为由计算分析的所有参数。由两者之间的关系可以确定（与双尾T-TEST确定）无显着差异。这表明，本实验中继空气冲击后，果蝇能够照常活动。